胰蛋白酶残留量检测酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书
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作者:proaaeda7
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发布时间: 2019-03-08
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本试剂盒用于测定重组蛋白药物或融合表达工艺中使用胰蛋白酶酶切，以及蛋白组学研究中使用胰蛋白酶的样本中重组胰蛋白酶或猪源胰蛋白酶的微量残留量检测。
胰蛋白酶残留量检测酶联免疫分析(ELISA)
试剂盒使用说明书
目的：本试剂盒用于测定重组蛋白药物或融合表达工艺中使用胰蛋白酶酶切，以及蛋白组学研究中使用胰蛋白酶的样本中重组胰蛋白酶或猪源胰蛋白酶的微量残留量检测。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术测定样品中胰蛋白酶的微量残留。原理：用抗体包被96孔酶标板，制成固相抗体，往酶标板中加入标准品和检测样品，与Biotin标记抗体桥联结合，再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算待测样品中胰蛋白酶的残留量。
试剂盒组成：
试剂盒组成
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96孔板配置
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保存
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说明书
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1份
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密封袋
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1个
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酶标包被板
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1×96
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2-8℃保存
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标准品
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1支
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-20℃保存
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标准品稀释液
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1.5mL×1瓶
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2-8℃保存
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Biotin标记抗体
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1支，1mg/ml
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-20℃保存
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Streptavidin-HRP
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1支
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-20℃保存
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样品稀释液
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6mL×1瓶
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2-8℃保存
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显色剂A液
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6mL×1瓶
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2-8℃保存
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显色剂B液
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6mL×1瓶
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2-8℃保存
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终止液
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6mL×1瓶
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2-8℃保存
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浓缩洗涤液
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6mL×1瓶
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2-8℃保存
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注：将标准品浓度依次稀释为：1000、250、62.5、15.6、3.9、1、0 ng/mL。
操作步骤:
1. 加样：标准品设定6个浓度点12个孔，每个浓度设定平行孔，加入100μL不同浓度的标准品。设置空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步操作相同）。用样品稀释液将样品稀释至适宜浓度后将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2. 温育：封闭酶标板后置37℃温育60分钟。
3. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
4. 洗涤：弃去酶标板中液体，甩干，每孔加300μL洗涤液，静置30秒后弃去，重复5 次，拍干。
5. 加生物素标记抗体：按1:30稀释Biotin标记抗体，50μL /孔。
6. 温育：封闭酶标板后置37℃温育60分钟。
7. 洗涤：弃去酶标板中液体，甩干，每孔加300μL洗涤液，静置30秒后弃去，重复5 次，拍干。
8. 加酶标试剂：按1:8000稀释Streptavidin-HRP，100μL /孔。
9. 温育：封闭酶标板后置37℃温育60分钟。
10.洗涤：弃去酶标板中液体，甩干，每孔加300μL洗涤液，静置30秒后弃去，重复5 次，拍干。
11.显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
12.终止：每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
13.测定：以空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
注意事项：
1．将试剂盒从冷藏环境中取出并在室温下平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓缩洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可水浴加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．请使用加样器进行加样，并经常校对其准确性，以避免实验误差。一次加样时间最好控制在5分钟以内，如样品数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如果样本值高于标准曲线最高浓度，请用样品稀释液稀释样本（n倍）后再测定，最后计算时乘以总稀释倍数（×n）。
5．底物请避光保存。
6．严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
8．试剂盒的试剂不能与其他批号的试剂或其他来源的试剂混合使用。
9. 请在本试剂盒标记的有效期内使用。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，分别带入对数函数，用其计算结果制作标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。实例：(仅供参考)
浓度(ng/mL)
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OD值
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1000
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1.7988
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250
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1.2654
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62.5
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0.7467
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15.6
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0.4217
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3.9
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0.225
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1
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0.1381
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0
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0.0551
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试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.99以上。
2.批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15%。
检测范围：
1.0ng /mL – 1000ng /mL
灵敏度：
最低检测浓度小于0.2ng /mL
保存条件及有效期：
1. 试剂盒保存：2-8℃。
2. 有效期：12个月。
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